2.1 試驗需求分析

1)需求主體：A-重復(fù)毒性試驗、A-單次毒性試驗、A-體外溶血試驗。

2)給藥制劑濃度范圍：0.1mg/mL~2mg/mL。

3)溶媒：0.9%氯化鈉注射液。

4)制劑配制方法：供試品A原液經(jīng)0.9%氯化鈉注射液稀釋，制備成所需濃度的給藥制劑。

5)制劑樣品處理方式：用溶媒將制劑樣品稀釋至0.1mg/mL~0.4mg/mL范圍內(nèi)檢測（適配儀器吸光度檢測范圍）。

綜上，供試品A配制流程簡單，制劑濃度較高，具備可稀釋檢測的條件。

2.2.分析方法開發(fā)思路

結(jié)合上文供試品A制劑濃度較高、配制簡單且無需復(fù)雜前處理的特性，選用紫外分光光度法檢測。該方法無需精密色譜儀器與復(fù)雜流動相，適配高濃度樣品檢測需求，操作簡便、檢測效率高且成本較低，可高效滿足本次A-重復(fù)毒性/單次毒性等多項毒理試驗的批量檢測需求，保障試驗進(jìn)度。

方法采用雙波長設(shè)計：ADC為抗體（mAb）與Linker-Payload（以下簡稱LP）的二元混合物，兩者在280nm處均有吸光響應(yīng)，但根據(jù)多組分混合體系的吸光度加和性，單波長無法直接精準(zhǔn)計算抗體濃度。由于290nm是LP的特征吸收峰，因此選取280nm與290nm雙波長，基于朗伯-比爾定律（A=ε×C×L，其中A為吸光度，ε為消光系數(shù)，C為濃度，L為光程）建立抗體濃度和ADC濃度的計算方法，如下公式，其中公式中各參數(shù)說明見表1：

表1 雙波長法檢測相關(guān)參數(shù)說明

注意事項：

1. 檢測過程中，雙波長切換時需分別對空白溶媒進(jìn)行校正，以消除背景干擾，確保吸光度檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確；

2. 抗體濃度計算公式較為復(fù)雜，計算過程中需仔細(xì)核對各項參數(shù)數(shù)值，若樣品經(jīng)過稀釋處理，需準(zhǔn)確回算原制劑濃度，避免結(jié)果偏差。

3.1 試驗需求分析

1)需求主體： B-重復(fù)毒性試驗（復(fù)合溶媒）、B-微核試驗（復(fù)合溶媒）；B-細(xì)菌回復(fù)突變試驗（單一溶媒）、B-染色體畸變試驗（單一溶媒）。

2)給藥制劑濃度范圍：0.01mg/mL~0.2mg/mL（復(fù)合溶媒）；45ng/mL~1mg/mL（單一溶媒）。

3)溶媒：復(fù)合溶媒（有機溶劑/表面活性劑/生理鹽水）；單一溶媒（有機溶劑）。

4)制劑配制方法：復(fù)合溶媒組需依次加入3種溶媒，將供試品溶解并混合均勻；單一溶媒組先用有機溶劑將供試品溶解至所需較高給藥濃度，再梯度稀釋至較低給藥濃度。

5)制劑樣品處理方式：用稀釋液將制劑樣品稀釋至線性范圍內(nèi)檢測。

綜上，5個毒理主試驗需求可分為兩類，需采用不同溶媒配制供試品，且所需制劑濃度存在差異；鑒于制劑整體濃度偏低，需采用色譜法/色譜法+質(zhì)譜法進(jìn)行檢測。

3.2.分析方法開發(fā)思路

3.2.1.復(fù)合溶媒組

結(jié)合上文試驗需求可知，該組采用復(fù)合溶媒配制時，制劑成分相對復(fù)雜，易產(chǎn)生檢測干擾，但供試品B濃度較高（對應(yīng)給藥濃度0.01mg/mL~0.2mg/mL）。

選取HPLC法檢測的核心原因的是，該方法兼具良好的分離能力與適宜的靈敏度，既能有效排除復(fù)合溶媒中各組分的干擾，避免雜峰影響定量準(zhǔn)確性，其液相響應(yīng)強度也可精準(zhǔn)滿足該組別微克級樣品的檢測需求，因此無需選用更精密的痕量檢測儀器也可兼顧檢測準(zhǔn)確性與經(jīng)濟性。

經(jīng)全波長掃描確定供試品B的最大吸收波長為254nm，選用Agilent C18色譜柱（4.6×100 mm），以含有TFA的水 -ACN為流動相，采用等度洗脫方式，可獲得峰型對稱、分離度良好的色譜峰。驗證結(jié)果顯示，B標(biāo)準(zhǔn)樣品在5-50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.999），制劑樣品的準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性均符合試驗接受標(biāo)準(zhǔn)（準(zhǔn)確度100±10%，相對誤差RE±10%）。

3.2.2.單一溶媒組

結(jié)合上文試驗需求可知，該組供試品B給藥制劑濃度范圍為45ng/mL~1mg/mL，整體濃度偏低，最低濃度可達(dá)ng級，屬于痕量檢測范疇。

選取LC-MS/MS法的核心原因是，HPLC法的檢測靈敏度有限，無法滿足ng級痕量樣品的精準(zhǔn)定量需求，而LC-MS/MS法兼具超高靈敏度與良好的分離能力，可精準(zhǔn)捕捉低濃度供試品B的信號，有效規(guī)避單一溶媒體系中潛在的微量干擾，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

試驗選用Agilent C18色譜柱（2.1×50 mm），以含酸的水-ACN為流動相，篩選合適的內(nèi)標(biāo)以減少檢測誤差，采用梯度洗脫方式優(yōu)化色譜分離效果。驗證結(jié)果顯示，B標(biāo)準(zhǔn)樣品在1-100ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.999），制劑樣品的準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性均符合試驗接受標(biāo)準(zhǔn)（準(zhǔn)確度100±10%，相對誤差RE±15%）。

4

方法特點總結(jié)與展望

結(jié)合本項目供試品A、B的試驗需求及方法開發(fā)實踐，ADC供試品制劑分析方法緊扣其“大分子抗體+小分子Payload”核心結(jié)構(gòu)，貼合非臨床毒理學(xué)試驗檢測需求，具有極強的實用性與可操作性。

其一，組分差異化適配性強，針對供試品A的大分子及高濃度特點，采用紫外分光光度法雙波長設(shè)計規(guī)避干擾，實現(xiàn)抗體精準(zhǔn)定量；針對供試品B的小分子及濃度差異，采用HPLC與LC-MS/MS法互補，適配兩種溶媒體系及不同濃度檢測需求。

其二，濃度覆蓋全面，檢測線性范圍涵蓋供試品A（0.1mg/mL~2mg/mL）與供試品B（45ng/mL~1mg/mL）給藥濃度，滿足各類毒理試驗需求。

綜上，ADC供試品制劑分析需嚴(yán)格遵循“組分差異化適配”原則，依托實驗室質(zhì)量體系保障數(shù)據(jù)合規(guī)可靠，通過系統(tǒng)的方法開發(fā)與驗證，建立了高專屬性、寬濃度覆蓋的分析方法，切實為ADC藥物非臨床毒理學(xué)研究的安全性評價提供有力支撐，也為后續(xù)同類ADC藥物供試品制劑分析方法的開發(fā)提供了可借鑒的實踐經(jīng)驗。

附表：ADC供試品檢測方法核心參數(shù)表

有濟醫(yī)藥建立了完整的非臨床藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)研究能力，在ADC藥物研究方面積累了豐富的研究經(jīng)驗。特別地，對于雙抗、雙payload等特殊類型的ADC藥物、PDX腫瘤藥效評價模型、中美雙報等特殊研究要求均具有經(jīng)驗，可以支持ADC藥物從PCC至IND的完整非臨床研究，及臨床階段的生物樣品分析和伴隨的毒理研究。