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企業(yè)展示NDC藥物（包括抗體偶聯(lián)藥物ADC、多肽偶聯(lián)藥物PDC等）代表了靶向治療的重要發(fā)展方向。這類藥物的基本設(shè)計(jì)理念是：通過連接子將高細(xì)胞毒性的Payload與靶向配體（抗體或多肽）偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)遞送，最終殺傷腫瘤細(xì)胞。 目前，NDC藥物的研發(fā)呈現(xiàn)出多元化格局。ADC領(lǐng)域已經(jīng)較為成熟，截至目前已有超過15款ADC藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市，涵蓋HER2、Trop-2、CD79b等多個(gè)靶點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、淋巴瘤、尿路上皮癌等多種惡性腫瘤的治療。PDC作為新興方向，近年來也取得了重要進(jìn)展，已有Pepaxto（melflufen）等藥物進(jìn)入臨床并獲加速批準(zhǔn)，雖然后續(xù)因臨床研究失敗而撤市，但PDC憑借其分子量小、腫瘤穿透力強(qiáng)、合成成本低等優(yōu)勢，仍被視為下一代靶向治療的有力候選者。 與ADC不同，PDC的分子量更小（通常2-10 kDa），作用機(jī)制更加靈活多樣：可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在溶酶體或胞漿中釋放Payload；可以利用細(xì)胞穿透肽直接跨膜入胞，不依賴受體識別；可以在腫瘤微環(huán)境（低pH、高GSH、特異性酶）中釋放Payload，Payload再進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用；或者作為整體復(fù)合物直接發(fā)揮藥效（如Lutathera）；甚至可以靶向膜表面受體，在不進(jìn)入細(xì)胞、不釋放Payload的情況下直接調(diào)節(jié)生物學(xué)功能（如Bicycle Therapeutics的雙環(huán)肽PDC—BT7480）。機(jī)制上的靈活性意味著其ADME特性更加復(fù)雜多變，對DMPK研究提出了更高要求。 然而，在NDC藥物的研發(fā)實(shí)踐中，一個(gè)令人困惑的現(xiàn)象反復(fù)出現(xiàn)：連接子設(shè)計(jì)精妙，藥效結(jié)果卻不及預(yù)期；考察體內(nèi)過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥物在血漿中穩(wěn)定性良好，卻難以在靶點(diǎn)部位有效積累；深入追蹤代謝命運(yùn)時(shí)更觀察到，母藥快速消失，游離Payload卻寥寥無幾。 這些困境的背后，折射出一個(gè)共性問題：我們只知道藥物進(jìn)入了體內(nèi)，卻不知道它去了哪里、變成了什么、為何沒能發(fā)揮作用。常規(guī)的母藥定量和總Payload測定，無法回答這些問題。而代謝產(chǎn)物鑒定（MetID），正是照亮這段黑暗旅程的那盞探照燈。 通過系統(tǒng)追蹤NDC分子在體內(nèi)的代謝足跡，MetID能夠直接鑒定那些被常規(guī)檢測忽略的關(guān)鍵代謝物，為理解藥效、指導(dǎo)優(yōu)化提供不可替代的證據(jù)。本文結(jié)合近年來的研究案例，梳理代謝產(chǎn)物鑒定在NDC藥物研究中的多重價(jià)值。
1 揭示Payload釋放后的真實(shí)形式：發(fā)現(xiàn)“活性喪失”的根源 連接子斷裂只是第一步，釋放后的Payload以什么形式存在，直接決定了其能否發(fā)揮藥效。有時(shí)，研究者雖然觀察到藥效不及預(yù)期，但常規(guī)檢測只能測量總Payload濃度，無法區(qū)分Payload是以游離活性形式存在，還是以其他形式被禁錮或失活。而MetID能夠直接鑒定釋放產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，揭示那些隱藏在藥效數(shù)據(jù)背后的關(guān)鍵代謝物。 案例：c(RGDfC)-SS-DOX為何藥效不佳？ Liang等構(gòu)建的RGD靶向PDC體系中，研究者采用三種不同連接子將環(huán)狀RGD肽（c(RGDfC)）與DOX偶聯(lián)[1]： c(RGDfC)-SS-DOX：可還原二硫鍵連接子 c(RGDfC)-S-DOX：不可切割的單硫鍵連接子 c(RGDfC)-VC-DOX：組織蛋白酶B可切割的纈氨酸-瓜氨酸二肽連接子 核心發(fā)現(xiàn)： 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示：c(RGDfC)-S-DOX和c(RGDfC)-VC-DOX的藥效是c(RGDfC)-SS-DOX和游離DOX的1.4-2.0倍[1] 通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）等分析手段，研究者發(fā)現(xiàn)c(RGDfC)-SS-DOX在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中會產(chǎn)生含巰基的DOX衍生物（DOX-SH），而其他連接子則釋放游離DOX[1] 這個(gè)案例說明了什么？二硫鍵連接子設(shè)計(jì)本意是在細(xì)胞內(nèi)高GSH環(huán)境中快速釋放Payload，但實(shí)際釋放出的卻是DOX-SH這種異常形式的Payload。雖然“釋放”發(fā)生了，但“釋放的形式不對”，導(dǎo)致藥效不升反降。這一發(fā)現(xiàn)揭示了PDC研究中一個(gè)關(guān)鍵問題：Payload釋放后的化學(xué)形式，與釋放本身同等重要。 MetID的價(jià)值：該研究通過CLSM等手段觀察到了DOX-SH的存在，并基于此解釋了不同連接子藥效差異的原因。這一發(fā)現(xiàn)恰恰說明了在NDC研發(fā)中，識別Payload釋放后的真實(shí)化學(xué)形式至關(guān)重要。而在藥物研發(fā)實(shí)踐中，代謝產(chǎn)物鑒定（MetID）是發(fā)現(xiàn)和確證藥物相關(guān)產(chǎn)物最有力、最直接的手段。當(dāng)我們在自己的NDC項(xiàng)目中遭遇“釋放率不低、藥效卻不高”的困境時(shí)，MetID就是追問“釋放出來的究竟是什么”的核心工具——它能夠系統(tǒng)性地發(fā)現(xiàn)那些可能被常規(guī)檢測忽略的異常代謝物，為理解藥效提供確鑿的分子層面證據(jù)。 2 描繪完整的代謝足跡：發(fā)現(xiàn)“中途下車者” NDC分子在體內(nèi)的命運(yùn)，遠(yuǎn)比“連接子斷裂釋放Payload”這個(gè)簡單模型復(fù)雜得多。通過系統(tǒng)追蹤藥物在血漿、尿液、膽汁、糞便中的所有代謝產(chǎn)物，MetID能夠描繪完整的代謝足跡，發(fā)現(xiàn)那些從未到達(dá)靶點(diǎn)的“中途下車者”。 案例：LN005的11個(gè)代謝物 LN005是一款由靶向多肽VAP與阿霉素（DOX）通過pH敏感連接子偶聯(lián)而成的PDC候選物，靶向腫瘤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高表達(dá)的GRP78蛋白。 研究者采用UHPLC-HRMS技術(shù)，對大鼠靜脈注射LN005后的血漿、尿液、糞便和膽汁樣本進(jìn)行了系統(tǒng)代謝物鑒定。這是首次對PDC藥物L(fēng)N005在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)可能的代謝物[2]。 圖1. LN005大鼠靜脈注射18 mg/kg的代謝圖譜[2] 研究還發(fā)現(xiàn)，LN005的代謝與DOX密切相關(guān)，主要代謝途徑包括：氧化脫氨或水解、還原性糖苷鍵裂解、水解性糖苷鍵裂解和脫氫反應(yīng)[2]。 MetID的價(jià)值：如果沒有MetID，研究者只會看到“血漿中母藥濃度下降”的數(shù)據(jù)，卻無法知道這些母藥究竟去了哪里——是被靶組織攝取并成功釋放Payload，還是在循環(huán)或肝臟中被提前代謝清除？LN005的研究通過系統(tǒng)代謝物鑒定，直接揭示了藥物在血液氧化代謝、肝臟攝取和膽汁排泄等多條“中途下車”路徑。 3 解析ADC的復(fù)雜代謝產(chǎn)物：發(fā)現(xiàn)“含Payload代謝物（PCCs）”的全貌 ADC藥物的代謝產(chǎn)物鑒定面臨獨(dú)特挑戰(zhàn)：含Payload代謝物（Payload-Containing Catabolites, PCCs）濃度低、結(jié)構(gòu)未知、分子量范圍寬。MetID技術(shù)的進(jìn)步正在突破這些瓶頸，為ADC的Payload設(shè)計(jì)和臨床前評價(jià)提供關(guān)鍵支持。 案例：T-DM1的含Payload代謝物研究 T-DM1（ado-trastuzumab emtansine）是一款經(jīng)典的以DM1為Payload、以不可裂解連接子（MCC）構(gòu)建的ADC。蔡婷婷等研究者開發(fā)了一種基于LC-HRMS的通用方法，用于系統(tǒng)鑒定不可裂解ADC的體外PCCs[4]。 研究設(shè)計(jì)： 將T-DM1和另一款A(yù)DC-1分別與人肝臟溶酶體、肝臟S9組分及腫瘤細(xì)胞共孵育 采用高分辨質(zhì)譜結(jié)合兩種數(shù)據(jù)挖掘工具：非靶向背景扣除（PATBS）和靶向產(chǎn)物離子過濾（PIF） 系統(tǒng)鑒定所有含Payload的代謝產(chǎn)物 核心發(fā)現(xiàn)： 在T-DM1的人肝臟溶酶體孵育體系中，共檢測并結(jié)構(gòu)表征了多種PCCs 這些PCCs的大多數(shù)由MCC-DM1與幾個(gè)氨基酸組成——即連接子-MCC與Payload DM1形成的綴合物上，連接著不同數(shù)量的氨基酸殘基 ADC-1在多個(gè)物種（人、大鼠、猴）肝臟S9及腫瘤細(xì)胞中，生成1個(gè)主要PCC和3個(gè)次要PCC，驗(yàn)證了Payload設(shè)計(jì)的合理性 MetID的價(jià)值：該研究系統(tǒng)揭示了不可裂解ADC在溶酶體中的代謝命運(yùn)——抗體部分被逐步降解，留下“連接子-Payload-氨基酸殘基”形式的PCCs。這些PCCs本身可能具有藥理活性，其生成和積累直接影響ADC的藥效和毒性。如果沒有MetID，研究者將無法發(fā)現(xiàn)這些PCCs的存在，也無法理解不可裂解ADC的活化機(jī)制。這一案例充分展示了MetID在支持ADC早期研發(fā)、指導(dǎo)Payload設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵作用。 4 建立種屬橋接，預(yù)判臨床風(fēng)險(xiǎn) NDC藥物的臨床前研究依賴于動物模型，但不同物種之間的代謝差異可能導(dǎo)致臨床轉(zhuǎn)化失敗。MetID可以在臨床前階段建立“代謝的種屬相關(guān)性”，為首次人體試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)評估提供關(guān)鍵依據(jù)。 案例1：ADC-1的種屬比較 在上述ADC研究中，研究者同時(shí)考察了ADC-1在不同物種肝臟S9中的代謝譜[4]。 核心發(fā)現(xiàn)： ADC-1在人、大鼠、猴的肝臟S9孵育中均生成相同的1個(gè)主要PCC和3個(gè)次要PCC 代謝譜在三個(gè)物種之間高度一致 MetID的價(jià)值： 動物模型的可靠性：如果在動物模型中觀察到ADC的代謝行為，且代謝譜與人相似，那么動物模型的結(jié)果對于預(yù)測人體代謝具有重要參考價(jià)值 Payload設(shè)計(jì)的驗(yàn)證：跨物種代謝譜的一致性，驗(yàn)證了該P(yáng)ayload設(shè)計(jì)在不同物種中具有相似的代謝命運(yùn) 臨床風(fēng)險(xiǎn)的早期預(yù)警：在臨床前階段就能了解ADC分子在不同物種中的代謝特征，為后續(xù)研究設(shè)計(jì)提供依據(jù) 案例2：LN005的種屬比較 PDC同樣適用這一思路。LN005的體外研究采用不同物種的肝臟S9組分孵育，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)主要代謝物，主要代謝途徑為氧化脫氨或水解。更重要的是，代謝譜在小鼠、大鼠、犬、猴和人之間高度相似[3]。 MetID的價(jià)值： 代謝途徑的可預(yù)測性：氧化脫氨和水解是跨物種保守的代謝通路，應(yīng)作為NDC設(shè)計(jì)的重點(diǎn)關(guān)注對象 臨床轉(zhuǎn)化的信心：跨物種代謝譜一致，為后續(xù)臨床研究提供了重要依據(jù) 5 指導(dǎo)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的“靶點(diǎn)地圖” MetID不僅能夠解釋代謝途徑，更能指導(dǎo)結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過明確主要代謝途徑和代謝脆弱位點(diǎn)，MetID為化學(xué)家提供了優(yōu)化的精準(zhǔn)方向。 來自PDC的啟示：LN005的主要代謝途徑 LN005的研究明確指出了主要代謝途徑——“氧化脫氨或水解”[2,3]。這些位點(diǎn)正是結(jié)構(gòu)優(yōu)化的靶點(diǎn)： 在易氧化位點(diǎn)引入空間位阻 用非天然氨基酸替代敏感殘基 來自ADC的啟示：T-DM1的PCCs結(jié)構(gòu)特征 T-DM1的PCCs結(jié)構(gòu)表征揭示了一個(gè)關(guān)鍵特征：PCCs由MCC-DM1與不同數(shù)量的氨基酸殘基組成[4]。這提示： 不可裂解ADC的活性形式可能不是游離Payload，而是“連接子-Payload-氨基酸”綴合物 在設(shè)計(jì)不可裂解ADC時(shí)，需要關(guān)注這種綴合物的活性和透膜能力 避免產(chǎn)生含巰基的Payload（如DOX-SH案例所示） 沒有MetID提供的代謝途徑信息，結(jié)構(gòu)優(yōu)化只能是盲目的“試錯”。 6 結(jié)語：讓每一個(gè)NDC的“體內(nèi)足跡”都清晰可見 從c(RGDfC)-SS-DOX研究中通過CLSM等手段發(fā)現(xiàn)的含巰基DOX衍生物[1]，到LN005研究中通過UHPLC-HRMS直接鑒定的11個(gè)代謝物[2,3]，再到T-DM1研究中系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的多種含Payload代謝物[4]，這些案例共同指向一個(gè)核心結(jié)論： NDC在體內(nèi)的命運(yùn)，遠(yuǎn)比“連接子斷裂釋放Payload”這個(gè)簡單模型復(fù)雜得多。常規(guī)檢測只問“母藥還剩多少”“總Payload有多少”，但MetID能追問“釋放出的Payload是什么形式”“藥物整體去了哪里”“變成了什么”。 當(dāng)研究者發(fā)現(xiàn)二硫鍵連接子釋放出的不是游離DOX而是DOX-SH時(shí)[1]，當(dāng)研究團(tuán)隊(duì)在LN005的糞便中發(fā)現(xiàn)超過一半的LN005相關(guān)物質(zhì)以水解產(chǎn)物形式存在時(shí)[2]，當(dāng)研究者系統(tǒng)鑒定出T-DM1的多種PCCs并揭示其由MCC-DM1與氨基酸殘基組成時(shí)[4]，這些發(fā)現(xiàn)都指向同一個(gè)事實(shí)：NDC在體內(nèi)可能生成多種Payload之外的分子，而這些“隱藏”的代謝物是理解藥物體內(nèi)過程的關(guān)鍵。 這正是代謝產(chǎn)物鑒定在NDC研發(fā)中的核心價(jià)值：作為發(fā)現(xiàn)和確證藥物相關(guān)產(chǎn)物最有力的手段，它讓研究者能夠系統(tǒng)性地揭示那些被常規(guī)檢測忽略的代謝物，為理解藥物的體內(nèi)命運(yùn)提供分子層面的證據(jù)。 科學(xué)的DMPK策略，是“因時(shí)制宜”的精準(zhǔn)設(shè)計(jì) 在NDC藥物研發(fā)的長周期中，DMPK研究不應(yīng)是僵化的“標(biāo)準(zhǔn)操作”，而應(yīng)是基于科學(xué)認(rèn)知的“動態(tài)適配”。在早期篩選階段，應(yīng)聚焦Payload本身的屬性，合理看待母藥數(shù)據(jù)的局限性——這是基于機(jī)制認(rèn)知的理性選擇；在PCC確認(rèn)階段，則需要攻堅(jiān)克難、建立可靠的MetID方法，這是對藥物研發(fā)負(fù)責(zé)的必經(jīng)之路。而貫穿始終的MetID策略，正是連接這些階段的橋梁——它讓研究者能夠全面追蹤藥物的代謝足跡，發(fā)現(xiàn)那些影響藥效的“隱藏變量”，為理解每一個(gè)分子的體內(nèi)過程提供關(guān)鍵證據(jù)。 有濟(jì)醫(yī)藥DMPK部門深耕偶聯(lián)藥物領(lǐng)域多年，在PDC、ADC等NDC新型藥物的體外ADME研究、體內(nèi)PK研究及復(fù)雜樣品分析方面積累了豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)。我們不僅提供標(biāo)準(zhǔn)化的DMPK服務(wù)，更致力于與申辦方一同探討基于項(xiàng)目階段、分子特性的科學(xué)定制化研究策略，將MetID等先進(jìn)工具融入研發(fā)全流程。讓我們攜手，以更智慧的DMPK策略，助力NDC藥物研發(fā)之路行穩(wěn)致遠(yuǎn)。 參考文獻(xiàn) [1] Liang Y, Li S, Wang X, et al. A comparative study of the antitumor efficacy of peptide-doxorubicin conjugates with different linkers. Journal of Controlled Release. 2018;275:129-141. [2] Wang W, Chen C, Luo J, et al. Metabolism investigation of the peptide-drug conjugate LN005 in rats using UHPLC-HRMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2024;238:115860. [3] Yuan Y, Wang W, Luo J, et al. Metabolite characterisation of the peptide-drug conjugate LN005 in liver S9s by UHPLC-Orbitrap-HRMS. Xenobiotica. 2024;54(1):1-9. [4] Cai T, Shi L, Guo H, et al. Detection and Characterization of In Vitro Payload-Containing Catabolites of Noncleavable Antibody-Drug Conjugates by High-Resolution Mass Spectrometry and Multiple Data Mining Tools. Drug Metabolism and Disposition. 2023;51(5):591-598.
